Als Sohn von James Haliburton (er änderte seinen Namen in Burton) und Elisabeth Westly 1788 in London geboren, wurde Burton am Trinity College in Cambridge erzogen, wo er 1810 seinen BA ( Bachelor of Arts) erhielt und seinen MA ( Master of Arts) im Jahr 1815. Zwischen 1815 und 1822 arbeitete Burton für den Architekten Sir John Soane und reiste mit seinem Sekretär Charles Humphreys durch Italien, wo er die Ägyptologen Sir John Gardner Wilkinson, Edward William Lane und Sir William Gell kennenlernte.
 
1822 nahm Burton eine Einladung von Mohammed Ali Pascha an, als Mineraloge mit dem Geological Survey of Egypt bei der Suche nach Kohle zu mitzuarbeiten. Burton hatte jedoch überhaupt keine Ahnung von Mineralogie und verließ das Geological Survey im Jahr 1824. Er wandte seine Aufmerksamkeit den antiken Monumenten Ägyptens zu. 1825 reiste auf dem Nil von Kairo bis Abu Simbel nach Süden. Auf seiner Reise verbrachte er mehrere Monate im antiken Theben. Er unternahm Grabungen bei Medinet Habu und Karnak und in verschiedenen Gräbern im Tal der Könige. Es war in diesen Monaten, daß er als Erster KV 5 betrat und einen Plan der ersten paar Kammern skizzierte.
 
Zwischen 1825 und 1828 veröffentlichte Burton die Excerpta Hieroglyphica, ein Band mit hieroglyphischen Inschriften. Über Burtons Aufenthaltsorte zwischen 1824 und 1834 ist wenig bekannt, aber am Weihnachtstag 1835 kehrte er mit Tieren, Dienern und Sklaven, und seiner Ehefrau Andreana, einem griechischen Sklavenmädchen, das in seinen früheren Jahren in Ägypten für ihn gekauft worden war, nach England zurück Kurze Zeit später wurde er von seiner Familie verstoßen.
 
Burton ist vielleicht am besten bekannt wegen seiner Zeichnungen und Pläne der altägyptischen Monumente, die von großem Wert sind, weil sie beim Vergleich des Zustandes der archäologischen Stätten im frühen 19. Jahrhundert mit dem von heute genutzt werden können. Außerdem sammelte Burton über die Jahre ägyptische Antiquitäten, die meisten davon wurden 1836 von Sothebys versteigert, um seine Schulden zu begleichen. Das einzige Stück seiner Sammlung, das nicht versteigert wurde, war eine Mumie und ein Sarg, die sich heute im Museum in Liverpool befinden. James Burton starb 1862 in Edinburgh und auf seinem Grab findet sich die Inschrift "Ein eifriger Forscher der Sprache und der Altertümer Ägyptens".